对癌症等疾病中组织复杂性的认识促使研究人员开发了多重免疫组织化学方法(mIHC)，在单张载玻片上检测数十种标记物。这些方法通过突出空间背景下单细胞水平的组织结构来深入了解疾病状态。
皮肤病理学家FrancescaBosisio和生物工程师FrederikDeSmet是鲁汶大学mIHC设施的联合主席。他们的旗舰高复数mIHC技术，抗体新沉积多重迭代标记(MILAN)，是一种循环染色方法，使用传统荧光抗体在同一张玻片上对多达80个标记进行染色。1在他们的设施中，他们为鲁汶大学及其他地区的科学家提供端到端mIHC服务。在接受《科学家》杂志采访时，Bosisio和DeSmet讨论了MILAN的起源和mIHC的好处。
MILAN方法是如何开发的?
FrancescaBosisio：当我在米兰比可卡大学担任住院医师时。我与GiorgioCattoretti一起工作，我们认为是时候在病理幻灯片上放置十多个标记了。为了开发mIHC方案，我们开始比较不同的抗体剥离方法。我们花了相当多的时间开发一种对组织温和的高效剥离解决方案。
然后我来到鲁汶大学读研究生，染色方法已经准备好进行测试了。我有一组39个表型和功能标记来研究原发性黑色素瘤组织的微环境。突然间，我有了大量的多重图像，但无法对其进行分析。我们花了两年时间从头开始开发自己的管道，从单细胞信号到推断组织中的细胞关系。这促使我们开发了自己的分析软件，并了解原发性黑色素瘤不同区域中T淋巴细胞的激活状态如何变化。2
MILAN与其他高复数mIHC方法相比如何?
FrederikDeSmet：大多数其他技术都局限于一厘米或更小的可染色区域。通过MILAN，我们分析了常规组织学载玻片的整个表面。
FB：我们不使用工程抗体;经过验证后，我们可以将任何感兴趣的抗体用于该项目。如果研究人员开发出了自己的抗体，我们可以立即实施。此外，MILAN使用二抗来放大信号。这允许捕获较低强度的信号，因此可以检测到的蛋白质表达范围比使用不带扩增系统的一抗时更广泛。
您的工厂如何优化MILAN方法?
FDS：我们策划从开始到结束的整个过程。当研究人员将样本带到我们的设施时，我们会有病理学家参与。整合空间数据和单细胞数据是一个挑战。让具有多年知识和培训经验的人员来观察染色的组织非常重要。在研究人员深入研究他们发现的相互作用之前，病理学家可以确定某些信号是否相关。
另请参阅“传统技术，新应用”
此外，我们拥有可以自动完成大量工作的内部仪器，这有利于标准化和数据质量。数据分析通常具有挑战性，因此我们正在研究一种解决方案，让没有生物信息学技能的人也可以了解不同表型中存在的表达水平。
你们都是癌症研究人员。mIHC如何使该领域受益?
FB：癌症具有复杂的免疫生态系统。有不同类型的炎症细胞对抗肿瘤，并且肿瘤本身是异质的，呈现不同的细胞状态。为了表征载玻片上的每个细胞，研究人员需要对每个癌细胞中的特定标记进行染色。通过这种方式，我们可以根据每位患者的特定癌症和炎症群体组成来展示其复杂的情况。如果我们能够看到患者特异性的异质性，我们就可以找到更好的药物来治疗患者的特定癌症。
在最近的一项研究中，我们绘制了黑色素瘤患者在接受免疫治疗之前的免疫表型。3mIHC的空间成分是造成我们结果差异的原因。为了确定患者是否会对免疫疗法产生反应，重要的是观察位于肿瘤特定部分的某些细胞类型上标记的表达。
FDS：对于胶质母细胞瘤，目前可用的免疫治疗方法效果不佳。为了探索新的策略，我们需要知道某些细胞的位置、它们如何相互作用以及组织结构。我们正在使用多重技术来了解一系列患者概况，并确定如何以个性化的方式进行干预。
米兰方法的前景如何?
FDS：下一阶段是将MILAN与其他技术相结合，例如执行mIHC并将转录组学叠加在同一张玻片上的单个细胞上。这增加了对疾病过程的复杂性和理解的另一个层次，而这些方法本身是不可能实现的。这就是最终目标。
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