子孢子肝浸润抗体

脊椎动物宿主的疟疾感染始于被感染的蚊子在其皮肤中沉积孢子。然后，子孢子进入循环，通过子孢子表面的周孢子蛋白(CSP)与肝血窦中的糖胺聚糖(GAGs)之间的强相互作用，迅速捕获肝血窦。首次报道子孢子CSP与肝脏GAGs的结合发生在肝细胞基底部分之外(Frevert等，1993；Cerami等人，1994年)。随后的研究证实，子孢子CSP与星状细胞合成的GAGs结合，并通过内皮腔突出到血管腔中(Pradel等人，2002)。这种相互作用不是宿主细胞识别的义务(Frevert等人，1996年)。显微研究表明，子孢子主要通过枯否细胞离开循环(Meis等，1983，1985；Vreden，1994年；Pradel和Frevert等人，2001年)是窦内衬的一部分，随后是潜在肝细胞的感染(Frevert等人，2005年)。在随后的研究中，使用了细胞内共聚焦显微镜和在内皮细胞中表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠细胞系，这提供了孢子也可以通过内皮细胞离开循环的证据(Tavares等人，2013年)。最近，枯否细胞CD68被鉴定为孢子体受体，这表明优先孢子体与枯否细胞相互作用的分子基础。在cd68敲除小鼠中，与野生型小鼠相比，小鼠的肝脏侵袭减少了70%以上(Cha等人，2015年)。

CD68作为子孢子受体的鉴定来自从噬菌体文库中筛选的三种肽-p39、P61和P52(Cha等人，2015)。这些肽不仅选择性结合库普弗细胞表面，而且竞争性抑制库普弗细胞进入肝实质。进一步的实验表明，这些与枯否细胞表面CD68蛋白结合的肽是疟原虫GAPDH在孢子表面的模拟表位(结构模拟物)。CD68和pGAPDH之间存在直接的相互作用，这对于库普弗细胞的子孢子穿越非常重要(Cha等人，2016)。

GAPDH除了在糖酵解中发挥主要作用外，还被认为是候选疫苗，因为它出现在几种病原微生物的表面，并作为宿主细胞识别和入侵的配体(潘乔李菲舍蒂等，1992，1997；Argiro等人，2000年；Rosinha等人，2002年；博格曼等人，2004年；Boel等人，2005年)。由于GAPDH在进化过程中是保守的，其氨基酸序列在病原体和高等生物之间高度相似，用全蛋白作为疫苗抗原是不现实的。因此，确定能够诱导产生保护性抗体的寄生虫的gap-dh特异性表位非常重要(Perez-Casal Potter，2016)。我们的研究表明，用klh标记的P39肽(一种GAPDH mimo壁)免疫小鼠可以获得很强的保护性免疫，而抗P39血清可以识别a GAPDH的蛋白。在这里，我们报道了一种表位定位方法，用于通过使用抗p39抗体来鉴定作为保护性表位的berghei GAPDH (PbGAPDH)的结构域。我们表明PbGAPDH独特的保护性表位位于蛋白质的C端，预计位于折叠蛋白质的暴露口袋中。

结果

多壁多肽P39、P61和P52作为免疫原性抗原保护伯氏疟原虫子孢子免受感染的评价

通过噬菌体展示肽库，我们发现了三种肽-p39、P61和p52-它们与库普弗细胞结合，并以这种方式强烈抑制子孢子的结合和进入(Cha等人，2015)。我们还发现P39肽免疫可以有效保护小鼠免受蚊虫叮咬引起的伯氏平孢子虫感染。图1A显示抗p39抗体可以识别与GAPDH具有相同流动性的子孢子蛋白。然而，另外两个肽p61和p52尚未被鉴定。我们用klh标记合成的多壁多肽免疫小鼠。所有三种肽的抗体都能识别重组pGAPDH(图1B)。然而，每种肽似乎都模拟了PbGAPDH的不同表位(图1C)。接下来，我们评估了每种候选mimo壁抗原的免疫原性和保护潜力。用三种多壁抗原的单一或不同组合免疫小鼠。然而，各组的总抗体浓度没有显著差异，P39的特异性免疫原性明显高于P52(图2A)。每次免疫后，两只感染的按蚊叮咬挑战贝氏按蚊。与klh免疫组相比，P39肽的免疫保护作用最强，对子孢子感染的抑制率为67%(图2B)。这些初始数据表明P39具有最强的保护潜力，因此它被用于所有后续实验。

(a)抗p39抗体在伯氏疟原虫子孢子裂解物的蛋白质印迹中特异性识别PbGAPDH。雨披染色和抗肌动蛋白抗体作为负荷对照。“S”:从受感染的千金藤唾液腺中纯化的子孢子的裂解物；“M”:从斯蒂芬斯未感染的唾液腺中提取的假裂解物。抗csp抗体作为子孢子裂解物的阳性对照。多克隆抗pbgapdh抗体(红色箭头)以与抗p39带相同的迁移率识别子孢子gapdh带。(b)每个mimo壁多肽(P39、P61和P52)的抗体识别具有相同的流程。

动性的条带为PbGAPDH(红色箭头)，而不是pET标记蛋白(蓝色箭头)。每个面板显示两个通道，左边仅包含pET标记蛋白，右边是标记的重组PbGAPDH蛋白。用于检测印迹的抗体显示在每个面板底部。抗标记和抗klh抗体分别作为阳性和阴性对照。用抗小鼠GAPDH抗体作为阳性对照，鉴定GAPDH蛋白。重组蛋白和标记蛋白的位置由右侧箭头指示。所有的数据都代表了两个独立的实验。(C)每个抗肽抗体都明确识别其自身的肽。显示在每个面板顶部的生物素化肽与链霉亲和素涂层的ELISA板的孔结合，并被每个面板底部的抗体结合测试。没有发现交叉反应的证据。所有数据都代表两个独立的化验。

mimo墙面多肽作为保护P·伯格伊感染的抗原的评估。

(一)肽免疫原性。小鼠免疫与单一抗原(50μg KLH-conjugated肽),结合两个抗原(25μg每个),或三种抗原的结合(16.7μg每个),表示。每隔2周注射三针后，用ELISA法测定每只小鼠产生的特异性抗体数量。顶部面板:总抗体浓度。每组小鼠的数量用括号表示。底部面板:特定抗体浓度。所有的数据都代表了两个独立的实验。错误条表示SD。(B)肽免疫预防感染。接种疫苗的小鼠受到两只被感染的史蒂芬尼蚊子的叮咬。用薄血涂片和姬姆沙染色法测定感染的流行程度，直到感染后12天。被感染小鼠的数量/被感染小鼠的数量和%的抑制在每个面板的底部。数据来自三个(单个抗原)或四个(混合抗原)独立实验。P值(*P < 0.05);* * P < 0.01;***P < 0.001)采用单因素方差分析(A)或Mann-Whitney U检验(B)计算，(A)每组小鼠数与(B)每组小鼠数相同。