从微量样品中解码生物分子的身份是生物技术领域的一个长期目标，虽然下一代测序技术已经可以识别单个DNA和RNA分子，但同样的功能尚无法用于蛋白质。但哈佛大学维斯研究所、哈佛医学院布拉瓦尼克研究所(HMS)和波士顿儿童医院(BCH)分子机器人计划的科学家们现在已经利用DNA创造了他们所说的世界上最小的统治者。测量蛋白质。
该技术被称为“DNA纳米开关卡尺”(DNC)，使研究人员能够通过施加少量的力对单个肽进行高精度距离测量。通过对同一分子快速进行多次距离测量，DNC创建了一个独特的“指纹”，可用于在后续实验中识别同一分子。
“当你试图理解生物学中的某些东西时，有两种主要的探究方法：你可以观察自然状态下的研究对象，或者你可以扰乱它并观察它的反应，”助理研究员韦斯利·黄博士说Wyss研究所的教员和HMS的副教授，同时也是BCH的研究员。“观察可以提供大量重要的生物信息，但有时了解某些事物的最佳方法是与其进行身体互动。通过施加力来确定肽分子内氨基酸的模式是正在进行的科学探索中的一个新范例，这些技术将使我们能够像目前对DNA进行测序一样轻松地对蛋白质进行测序。”
Wong是该团队在《自然纳米技术》上发表的论文的通讯作者，论文题为“使用DNA纳米开关卡尺进行单分子机械指纹识别”。
蛋白质在几乎所有生物过程中都发挥着至关重要的作用，但这些分子比DNA和RNA复杂得多，并且经常经过化学修饰，这使得样品中单个蛋白质(单分子蛋白质组学)的识别具有挑战性。作者写道：“DNA分析的进步极大地影响了临床实践和基础研究，但蛋白质的相应发展由于其相对复杂性和我们无法放大它们而面临挑战。”“一种准确、全面分析痕量样品中蛋白质的方法将影响从诊断到细胞生物学的各个领域，但仍然是一个极具挑战性的目标......尽管质谱法和质谱流式细胞术等方法取得了进展，但单分子蛋白质鉴定仍然是一个极具挑战性的目标客观的。”
DNC基于DNA纳米开关的底层技术。实际上，这是一条单链DNA，在其长度上的多个点上附有分子“手柄”。当其中两个手柄相互结合时，它们会在DNA链中形成一个环，并且链的总长度会缩短。当用力将手柄拉开时，线绳会延伸回其原始长度。处于环状和非环状状态的线的长度之间的差异反映了环的尺寸，从而反映了手柄之间的距离。
研究小组意识到他们可以将DNA纳米开关更进一步。如果他们将手柄设计为与生物分子结合，那么手柄可以像卡尺的两个尖端一样有效地在它们之间“夹住”分子，而不是相互结合。通过测量在手柄之间添加目标分子如何改变DNA纳米开关在环状和非环状状态下的总长度，研究小组假设他们可以有效地测量分子的大小。
“在某些方面，DNA纳米开关利用了一种最经典的机械方法来测量物体：只需对某物施加力，然后观察它的反应如何变化，”共同第一作者、Wyss博士后研究员DarrenYang博士说。研究所和BCH。“我们还没有真正看到这种方法用于单分子蛋白质组学领域，因为对如此小的物体施加力是非常具有挑战性的。但我们迎接了挑战。”
为了将他们的基于力的新测量技术的想法变为现实，Yang和同事首先将两种不同类型的手柄连接到目标分子：一个“强”手柄将分子牢固地锚定在DNC的一端，以及多个手柄。可以连接到DNC另一端的“弱”手柄。然后，他们将DNC的两端拴在两个悬浮在激光束中的光学捕获珠上。通过将珠子移得更近，他们诱导目标分子的弱手柄之一与DNC结合，形成环状状态。然后，当他们通过将珠子进一步移开来增加力量时，弱手柄最终释放了其键合，使DNC恢复到更长的、未成环的状态。”
“DNA纳米开关是在特定位点装饰的DNA系链，其功能可以直接相互结合或通过第三个桥接复合物结合，”作者解释道。“结合导致纳米开关的一部分环出，缩短了系链长度;当这些键断裂时，系链会延伸回原来的长度……本质上，从环状结构到非环状结构的长度变化反映了闭合环的分子桥的大小——桥越大，长度变化越小”。
该团队首先在简单的单链DNA(ssDNA)分子上测试了DNC技术，并证实DNC的环状和非环状状态之间的距离测量变化与目标分子的长度直接相关。这些长度变化可以以埃级精度(比DNA双螺旋宽度小十倍)进行测量，从而能够识别与单个核苷酸一样小的长度变化。
由于目标分子包含多个可以与DNC结合的弱手柄，因此结合和破坏这些手柄的重复循环会在强手柄和弱手柄之间产生一系列距离测量值，这些距离测量值对于每个测量的分子来说是唯一的。这种“指纹”可用于识别样品中的已知分子，或推断未知分子的结构信息。
在确认DNC可以可靠地测量DNA分子的大小后，研究人员将注意力转向蛋白质。他们设计了一种已知长度和序列的合成肽，并重复实验，通过强手柄将其连接到DNC的一端，并通过施加不同大小的力反复连接和破坏其弱手柄和DNC之间的键。
他们发现，他们的工具测量的强手柄和弱手柄之间的所有距离都与根据DNC长度和肽中氨基酸长度预期的距离相匹配。当他们使用DNC测量天然存在的线性化肽NOXABH3时，也得到了类似的结果。
该过程还为每种肽生成了独特的测量指纹。“对单个分子进行多次距离测量可以创建可用于蛋白质识别的机械指纹……”他们写道。该团队创建了一个计算机模型来预测使用这种方法可以唯一识别多少人类蛋白质，结果发现常用蛋白质数据库中超过75%的蛋白质可以通过指纹识别，概率至少为90%。
“实际上，我们对这项技术的效果感到有些惊讶，”共同第一作者、Wyss研究所和BCH的博士后研究员PrakashShrestha博士说。“光镊已经存在了几十年，而在环状和非环状状态之间循环DNA也已经存在了大约10年，我们不确定是否可以通过结合这些想法来获得足够高分辨率的测量。但事实证明，这些指纹对于识别蛋白质非常有效。”
识别单个蛋白质分子本身就是一项令人印象深刻的壮举，但能够同时识别多个蛋白质才是单分子蛋白质组学的真正圣杯。该团队进一步证明，通过用磁镊系统替换光珠，他们能够并行测量多种不同的肽，并确定不同分子的相对浓度。他们写道：“使用光镊，我们展示了对DNA和肽的埃级精度的绝对距离测量，并使用多重磁性镊子，我们展示了混合样品中相对丰度的量化。”
“我们还展示了如何通过在多路磁镊系统上实施该测定来通过并行化来提高通量。这使我们能够测量异质混合物中不同比例的肽的相对浓度。”
共同通讯作者WilliamShih博士是Wyss研究所的核心教员，同时也是HMS和Dana-Farber癌症研究所的教授，他进一步评论道：“由于规模化和分辨率方面的挑战，单分子蛋白质组学在很大程度上仍然是一个白日梦。。我们目前的工作表明，基于力的序列指纹识别有潜力实现这一梦想。我们的最终目标不仅是高效读取蛋白质序列，还以高通量方式有效读取蛋白质结构。”
科学家们实现这一目标的下一步是验证他们的卡尺对折叠蛋白质及其复合物的低力结构测量，研究它们在结构生物学和蛋白质组学中的潜在用途。他们写道：“DNC有可能用于测量蛋白质折叠结构中多个残基之间的距离，这将能够表征生物分子和生物分子复合物的动态3D结构，补充现有的结构阐明生物物理方法。”
该团队还致力于提高该技术的吞吐量，以进一步加快混合样品的分析速度。“DNC还可以集成到其他力谱方法中，以纳入额外的功能或提高动态范围、空间精度或吞吐量，”他们建议。“DNC提供了一种强大的方法来表征纳米级复合物内的距离和几何形状，有可能影响从蛋白质组学和纳米技术到结构生物学和药物发现的广泛领域。”
“这项研究将分子生物物理学与Wyss研究所首创的尖端DNA纳米技术相结合，使我们能够以一种真正新颖的方式与生物分子相互作用并进行分析，”Wyss创始人、医学博士、哲学博士DonIngber说道。JudahFolkman是哈佛医学院和BCH血管生物学教授，也是哈佛大学约翰·A·保尔森工程与应用科学学院生物工程教授。“当威廉和韦斯利第一次将这个想法作为新成立的分子机器人计划的核心挑战时，它确实看起来像是科幻小说，但这正是我们想要在Wyss开展的项目类型。我为团队使这项技术成为现实感到非常自豪——它有可能彻底改变我们进行科学研究和开发治疗方法的方式。”
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