光——以及所有波——可以绕过沿其路径发现的障碍物的角落。由于这种称为衍射的现象，不可能将光聚焦到小于其波长一半的光点上。换句话说，理论上使用光学显微镜可以达到的最高分辨率约为 250 nm，这是一个称为衍射极限的障碍。不幸的是，这种分辨率不足以观察精细的细胞结构，例如在神经元中发现的细胞结构。
一个多世纪以来，在超分辨率荧光显微镜发明之前，显微镜学家一直被这一经典障碍所束缚。1990 年代后期开发了一种特别强大的方法，并创造了受激发射损耗 (STED) 显微镜。这种技术要求目标样品含有荧光团，荧光团是一种在一个波长处吸收光然后在更长的波长处重新发射的化合物。在 STED 显微镜的最简单版本中，通过衍射极限聚焦激光的照射，荧光团在圆形光斑中被激发。然后，用能量较低的光(耗尽光束)照射光斑周围的甜甜圈形部分，通过受激发射过程关闭荧光。因此，净效应是只有甜甜圈中心的荧光团重新发射光子，
尽管 STED 显微镜是在更高分辨率下观察活神经元形态的真正突破，但仍有改进的空间。在最近发表在Neurophotonics 上的一项研究中，由波尔多大学的 U. Valentin Nägerl 博士领导的一组科学家开发了一种简单而有效的校准方法，可以在更高的组织深度进行更精确的 STED 成像。他们的方法基于分析和校正生物样品 STED 显微镜系统误差的主要来源之一：耗尽光束的球面像差。
当在高于 40 μm 的深度对组织样本进行成像时，耗尽光束会遭受各种类型的散焦和退化(像差)并失去其精心设计的形状，这对于 STED 方法至关重要。球面像差是最大的问题，也是研究人员的目标。他们的策略是首先准备一个脑组织模型样本，这是一种基于凝胶的代理，其折射率与实际大脑的折射率相似。这个体模样本包含均匀分散的荧光团和金纳米粒子，这使团队能够清楚地可视化和量化耗尽光束的形状在穿透更深时如何变形。然后，他们根据组织深度计算了应该对耗尽光束进行的必要预调整，使其最终形状更接近理想形状。
一旦根据体模测试校准了耗尽光束的形状，科学家们就开始对活体神经组织进行成像。他们比较了常规 STED 显微镜、校正 STED 显微镜和双光子显微镜(一种专门针对深层组织成像进行调整的技术)的结果。结果非常令人信服：校正后的 STED 图像比标准 STED 图像更能捕捉到更深神经树突的精细细节。“使用我们的校准策略，我们可以在生物组织内部 90 μm 的深度测量小至 80 nm 的神经元结构，并在校正球面像差后获得 60% 的信号增加，”Nägerl 说。
约翰霍普金斯大学生物医学工程教授姬毅评论说：“超分辨率显微镜主要应用于薄样品，例如单层细胞，光散射可以忽略不计。由 Valentin Nägerl 领导的团队在两个- 光子受激发射损耗显微镜 (2P-STED)，通过 90 微米脑组织实现了 80nm 成像神经元树突棘的分辨率。这是值得注意的，因为在较厚的组织中很难保持超分辨率——特别是考虑到高散射质量脑组织。”Yi解释说，这一进步将促进对神经活动和相互作用的研究。
考虑到这种新颖的校准过程稳健、易于实施且相对便宜，它可以很容易地融入标准实验室实践中，以便使用 STED 显微镜获得更好的结果，只要制备的体模样品与生物标本的光学特性相匹配。在这方面，Nägerl 表示：“我们的方法不仅限于大脑样本;它可以适用于具有已知且相对均匀的折射率的其他组织，以及其他类型的制剂，甚至可能适用于完整的活小鼠大脑。 ”
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