由爱媛大学医学研究生院的 Takashi Saito 领导的一个研究小组开发了一种 2 光子激发光片荧光显微镜，它 (1) 降低了光毒性，(2) 扩大了视野，(3) 提高了空间解析度。该显微镜用于观察青鳉鱼时，可以在不影响鱼的生长(低光毒性)的情况下，以细胞级分辨率(高空间分辨率)观察整个胚胎(扩展视野) )超过三天的胚胎发育。这一结果发表在科学期刊《自然通讯》(Springer Nature)上。
1. 背景
荧光显微镜广泛应用于生命科学领域，以非侵入性的方式观察细胞内的分子。光片荧光显微镜可以以高采集速度和高空间分辨率记录三维图像。然而，在传统的光片显微镜中，难以限制对活组织的光损伤，也难以同时实现宽视场和高(细胞级)空间分辨率。
2. 双光子激发宽视场光片显微镜的研制
Takashi Saitou、Sota Takanezawa 和 Takeshi Imamura 的爱媛大学研究小组利用双光子激发现象作为解决这个问题的关键。带有红外激光的双光子激发显微镜可以对活生物体进行温和(低光毒性)成像。然而，由于光必须聚焦在狭窄的范围内才能诱发双光子激发，因此激发范围(在光片显微镜中，视场)很窄。为了解决这个问题，我们开发了带有贝塞尔光束的简单照明光学单元，可在光轴方向上扩展激光传播范围(图 1A)。当使用 10 倍放大率 NA0.3 物镜时，该装置可以将光束长度拉伸到 600-1000 μm，同时保持 2-3 μm 的轴向分辨率。使用这个光学装置，
3. 实时成像应用
青鳉被广泛用作脊椎动物的模式生物。由于体积小且透明，因此适用于荧光成像。为了评估我们的显微镜在生物体上的适用性，我们进行了光毒性评估。与传统的高斯光束光片显微镜相比，这表明光损伤减少。因此建议适用于长期实时成像。然后我们应用了转基因青鳉的长期延时成像，其中淋巴管内皮被绿色荧光蛋白标记，并在三天内以 5 分钟的间隔成功地进行了实时成像(图 2)。
4. 研究意义
在这项研究中，我们开发了一种新的高性能光片荧光显微镜。使用这项技术，我们可以在整个鱼体上以高细胞分辨率观察青鳉鱼几乎所有的胚胎生长过程。该技术有望为胚胎发育的分子水平理解、生活方式相关疾病发病机制的阐明以及药物开发技术的进一步发展做出贡献。
标签： 光片显微镜装置
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