2021年8 月 18 日——科学家们使用牛津纳米孔技术公司 (ONT) 的长读长测序平台开发了一种新的实验室协议和生物信息学管道，用于探索环状 RNA (circRNA) 的组成。该技术于 8 月 10 日发表在Nature Communications 上，表明在 circRNA 中优先发现了一组微外显子——小于 30 个核苷酸的外显子——以前与自闭症有关。
CircRNA 是一种单链 RNA，与线性 RNA 不同，它形成共价闭合的连续环。此外，circRNA 是非编码的，但仍然在各种细胞过程中发挥功能作用。
RNA中只有一小部分是circRNA(约1%)，科学家们对circRNA生物学的了解还很有限，包括它的生物起源、调控表达以及在哺乳动物细胞中的功能。在中枢神经系统中，circRNA 似乎与大脑发育和炎症有关，并且已知它们可作为癌症的生物标志物。一种特殊的 circRNA，ciRS-7/CDR1-AS，已被证明在从小鼠大脑中取出时会引起认知变化。
理解 circRNA 组成的挑战之一是，到目前为止，只能使用读取短片段 RNA 的测序技术来描述 circRNA，这是当前技术状态所施加的限制。
相比之下，新方法提供了一种对 circDNA 进行长读长测序的方法。研究人员应用牛津纳米孔平台的长读长测序技术来描述人和小鼠脑组织样本中全长circRNA的外显子(基因的编码部分)组成，以及相应的mRNA。
为了将 circRNA 归零，该小组由丹麦奥尔胡斯大学分子生物学和遗传学系的 Karim Rahimi 博士领导，进行了一项富集方案，其中用 RiboZero 处理小鼠或人脑组织样本的总 RNA，以去除核糖体 RNA 并使用 RNase R 去除线性 RNA。执行额外的聚腺苷酸化步骤，然后去除聚 (A)，以确保去除所有线性 RNA。
接下来，研究人员在长读长测序(circNick-LRS)之前对富含 circRNA 的池应用“温和”水解，然后进行 3' 末端多聚腺苷酸化以与标准 ONT 协议保持一致。
在使用 circNick-LRS 进行长读长测序后，研究人员能够表征人脑中的 18,266 个 circRNA 和小鼠大脑中的 39,623 个。相比之下，短读长测序检测到 3,740 个人类 circRNA 和 5,299 个小鼠 circRNA。
在 circNick-LRS 检测到的 circRNA 中，在人和小鼠脑样本中均发现了 5,537 个，分别占检测到的人和小鼠 circRNA 的 30.3% 和 14%。这组作者说，这与之前的研究相当，表明该方法在检测 circRNA 方面是可靠的。
测序结果表明，circRNA与线性RNA不同，表现出大量剪接事件，如新外显子、内含子保留和微外显子。作者推测，circRNA 中的微外显子可以作为蛋白质或微 RNA 的转录调节因子或结合位点。
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