2021年8 月 23 日——一种新的 CRISPR 基因编辑筛选方法可用于将动物模型中的表型和基因型联系起来。根据8 月 19 日发表在《科学》杂志上的一篇论文，该方法在斑马鱼中得到了有效部署，并显着减少了评估数百个基因功能所需的时间。
正向遗传学是一种用于确定导致表型的遗传基础的分子遗传学方法，需要大量时间和劳动力。这种方法需要创建模式生物，例如斑马鱼——它们与人类共享大部分基因——显示正在研究的特征。育种后，分离出具有所需表型的突变体并鉴定基因。
反向遗传学方法有可能缓解正向遗传学的一些问题，但在过去，它们受到严重受限的吞吐量能力的阻碍。在反向遗传学中，可以通过分析细胞表型来确定基因序列的影响。通过选择性地修改基因，研究人员可以在整个生物体中寻找影响。
CRISPR 技术已广泛用于反向遗传方法。然而，通常使用引导 RNA (gRNA) 一次完成一个目标基因，然后将 Cas9-gRNA 核糖核蛋白复合物注射到动物模型中。这导致单个基因的关闭。如果研究人员想要针对不同的基因，他们需要设计额外的 gRNA 并将其注入不同的生物体。
犹他大学健康学院药学院院长兰德尔·彼得森博士在一份声明中说：“这个过程一直集中在单个基因或一次修改上。” “所以，如果你想做 100 个基因，它的工作量是其 100 倍。”
犹他大学健康大学的研究人员开发了一种称为多重混合 CRISPR 液滴 (MIC-Drop) 的平台，用于在斑马鱼中进行大规模反向遗传筛选。
研究人员从解决特定科学问题的目标 gRNA 库开始。该平台使用微流体技术生成纳升大小的液滴。每个液滴都包含靶向目标基因的 Cas9 多重 gRNA 和与每个目标基因相关的条形码。这些液滴混合在一起以累积靶向数百到数千个不同的基因。
该团队用一根针将混合的液滴注射到斑马鱼胚胎中。培育了数百个斑马鱼胚胎;那些表现出感兴趣的表型的被分离出来，并通过测序条形码揭示了扰动基因的身份。
Herron 提供。
博士后研究员 Saba Parvez 博士解释说，以前，在斑马鱼中设置数百个基因的 CRISPR 筛选需要一个研究小组花费数天时间，并且需要数百根针，他开发并优化了 MIC-Drop 的包装技术和条形码系统。
“现在，您已将该流程简化为一个用户在几个小时内完成，”Parvez 说。
为了测试 MIC-Drop 是否可以识别导致特定表型的基因，研究人员将含有靶向 tyr(酪氨酸酶)或 npas41(神经元 PAS 域蛋白 2)基因的 gRNA 的液滴加入含有其他 gRNA 的液滴中，占总数的 2% . tyr 基因与白化病相关，npas41 基因与 cloche 表型(有缺陷的心脏结构)相关。
数百个胚胎被注射了混合液滴，并记录了白化和钟形表型的频率。研究人员分别观察到 1.7% 的白化和 2.2% 的 cloche 表型频率，这与预期频率相匹配。
科学家们还使用该平台来识别 optivin 的靶标，optivin 是瞬时受体电位阳离子通道亚家族 A 成员 1b (trpa1b )的小分子激动剂。实验表明 trpa1b 基因型是斑马鱼胚胎疾病表型的主要原因。
最后，为了测试 MIC-Drop 是否可以识别对心脏发育或功能的特定方面有贡献的基因，研究人员评估了 188 个在心脏发育中具有潜在作用的基因。在创建针对所有 188 个基因的 gRNA 并将它们引入胚胎后，发现了发生心脏缺陷的鱼。
DNA 条形码用于识别具有形态表型的 13 个新基因，这些基因丢失后会导致各种特定的心脏或血液表型，例如卟啉症(血红素障碍)、心律失常和心脏发育异常。
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