当AlexRosenberg博士和CharlieRoco博士还是华盛顿大学GeorgSeelig实验室的研究生时，他们在白板上提出了如何提高单细胞RNA测序(scRNA-seq)可扩展性的想法。当时，大约五年前，“大规模约为100个细胞，”罗森伯格说。他们将自己的想法发展为基于分割池连接的转录组测序(SPLiT-seq)的技术。
Rosenberg表示，2018年概念验证论文在《科学》杂志上发表后，电子邮件就开始滚滚而来。他说，“大量”团体主动联系，询问如何在自己的系统中设置SPLiT-seq实验室。两名学生一获得博士学位，就抓住了这个机会，创办了一家名为SplitBiosciences(最近更名为ParseBiosciences)的公司，将该技术商业化。
ParseBiosciences的研究人员。
上周，在美国人类遗传学学会(ASHG)年度会议上，ParseBio团队发布了一款配有数据分析软件的新试剂盒。该产品允许任何研究人员使用单细胞悬浮液并进行DNA测序，对多达100万个细胞进行scRNA-seq。
更好的捕鼠器
就在Rosenberg和Roco发表SPLiT-seq论文的三年前，来自波士顿的两个研究小组——一个来自布罗德研究所，由EvanMacosko博士领导，另一个来自哈佛医学院，由MarcKirschner博士领导——连续发表了《细胞》杂志上的论文描述了基于微流体的方法来分离液滴中的单个细胞。第二年，10XGenomics推出了基于这些技术的Chromium系统。从那时起，10XGenomics已成为该领域的既定领导者，并帮助发起了scRNA-seq革命。
但罗森伯格认为还有改进的空间，并且ParseBio的试剂盒比当今现有的技术更好。他说，由于SPLiT-seq的简单性，它缺乏基于液滴的方法中的一些限制。一个例子是，细胞的大小在SPLiT-seq中并不重要。这一优势以及其他优势使得scRNA-seq更易于使用且更容易扩大规模。
细胞是隔室
单细胞正是如此，基于微流体的系统促进了细胞的物理分离。每个细胞都位于其自己的单独隔室中，可以用特定于其部分的条形码单独标记。
但SPLiT-seq的工作原理不同——细胞之间并不是物理隔离的。细胞是隔室。为此，细胞被固定然后透化。生化试剂进入细胞，细胞内发生化学反应，并添加条形码。使用组合条形码，该方法可以标记大量细胞。
理论上，无需额外的台式机器，任何分子生物学实验室都可以使用SPLiT-seq进行scRNA-seq实验。使用完试剂盒后，即可制备出可在任何测序仪上进行测序的文库。然后使用套件中包含的软件分析数据。
ParseBio自今年2月起推出了一款试剂盒(EvercodeWholeTranscriptomeKit)，可以对100,000个细胞进行scRNA-seq。上周，在ASHG上，该公司推出了可进行一百万个细胞的EvercodeMega，以及用于小型实验的EvercodeMini。
一切都与概率有关
SPLiT-seq如何解析出一百万个细胞?Rosenberg是这样解释的：如果你从100万个细胞开始，将它们分成96个孔，每个孔大约有10,000个细胞。一个孔中的每个细胞都有一个条形码。那是10,000个带有一个条形码的细胞——不完全是一个唯一的标签。然后，将细胞汇集在一起并再次随机分配到具有96个新孔的第二个板中。当每个细胞开始采取独特的路径通过这些孔时，每个孔中都会添加第二个条形码。这个过程通过第三轮和第四轮再次完成。随着协议的进展，任何两个细胞获得相同条形码组合的概率变得越来越小。
然而，两个细胞有可能一起穿过所有四轮，形成双联体。在其他基于液滴的技术中，两个细胞也有可能最终出现在同一个液滴中。当尝试使用液滴扩大规模时，随着放入更多的细胞，双联体的可能性会增加。
鉴于组合条形码的指数性质，SPLiT-seq产生的双联体数量较少。可以使用涉及小鼠细胞和人类细胞混合的标准方法来测量双联体。使用该技术，在100万个细胞中，ParseBio试剂盒观察到的双联体率为3.2%。真正的双峰率是其两倍。
战利品归胜利者所有
与任何打入已经成熟市场的技术一样，SPLiT-seq需要克服市场障碍有一条艰难的道路。在过去五年中，scRNA-seq呈爆炸式增长，这主要归功于10XGenomicsChromium，它在全国各地的核心基因组学设施中启动并运行。西海岸一家学术机构的一位研究人员告诉GEN，他们的实验室已经开始使用Chromium生成一个大地图集，现在不打算改变。
任何一家DNA测序公司都可以证明，开发新基因组技术的游戏并不是那些厌倦竞争的人所玩的游戏。但当Rosenberg告诉GENParse的产品“几乎在每个轴上都比竞争对手更好”时，他明确表示他已准备好离开替补席。
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