微量杂质干扰科学观测不仅在偶联反应催化中存在

今年初《自然催化》杂志发表一篇中国科学家有关胺催化Suzuki反应的发现，因为这个反应通常需要过渡金属钯的催化、所以文章发表后就引起不少专家质疑。德国和匈牙利的科学家用灵敏的检测技术测定了胺催化剂中的钯含量，确实发现这些有机催化剂中有每公斤毫克级的钯存在。最近这篇文章正式撤稿，作者做个更深入的研究发现却是是微量钯络合物催化了这个反应。现代有机化学中钯几乎无处不在，所以很难找到完全没有钯的反应环境、造成多个小组先后发现所谓无钯催化偶联反应的乌龙。

药源解析

微量杂质干扰科学观测不仅在偶联反应催化中存在，药物化学中同样存在大量类似干扰因素，所以初筛得到的苗头化合物通常要经历一系列的反向筛选(counter screen)去把在你筛选化合物所用测试中有一定表观活性、但无法继续优化滥竽充数、狐假虎威的不靠谱分子从革命队伍了清理出去。随着中国制药企业进入更早期新药研发的竞争，这个工作会逐渐提到议事议程。大小分子药物先导物产生有很大区别，今天主要谈谈小分子药物先导物发现的反向筛选。

与跟踪策略如me-too、me-better一开始就有优质先导物不同，全新靶点药物开发你是从零开始的。立项不在是根据别人靶向这个靶点的药物在二期临床已经有了阳性数据，而是要根据细胞、动物实验(多数是基因敲除实验)、人体基因变异等间接数据去判断，这本身是一个高度复杂的工作、但不在今天的讨论范围内。你看好一个靶点后首先要表达这个蛋白，这虽然不是个闲庭信步的事、但不是主要障碍。下一步就是要有一个足够大、足够多样化的化合物库，这个就需要长期积累才能做到。DEL虽然可以快速产生数亿级别的库但多样性非常有限，高质量小分子库需要数十年的积累。

有了靶点蛋白和供筛选的化合物库，下一个任务是设计筛选标准(assay)。因为你对未来先导物一无所知所以通常要筛选大量化合物，这要求你的筛选通量要达到一定水平、也不能消耗太多化合物。直接看动物模型疗效一般是不行的，一是一年也筛不了几个化合物、二是这么筛的话两个项目就把你化合物库掏空了。现在常用的高通量测试方法主要是根据配体与靶标蛋白结合力和对蛋白功能(如催化、受体信号传递对等)的调控，不需要多少化合物、测试速度和通量也高。但是这类所谓高通量筛选也比较糙，经常会发生类似无钯催化偶联反应这种乌龙、需要反向筛选剔除假阳性苗头化合物。

第一件事就是看看你化合物的纯度，有些化合物不稳定、长时间放置会降解，有些合成时就没纯化好，有些可能结构就定错了。这些明显的错误纠正后就要考虑隐藏比较深的杂质了，类似微量钯对偶联反应的影响。很多靠Cys催化的酶因为巯基可与过渡金属络合所以对微量金属非常敏感，nM水平的金属就可以抑制这些酶的活性、导致大量含有过渡金属的化合物样品给出假阳性数据。加入EDTA清除游离过渡金属通常可以消除这类干扰。

即使活性真正来自结构式所指向的化合物，有些化合物也是无法优化的。比如有些化合物在uM浓度容易形成聚合物(aggregation)令蛋白，所以给出uM活性、但无论你怎么改造结构也不会提高活性。把这类妖怪打回原形的办法是稀释测试系统，因为无法形成聚合物所以活性消失。还有一些化合物含有一些可以与蛋白表面亲核氨基酸反应的基团，除非是你准备设计共价化合物并有优化路径否则这类化合物也很难继续优化。剔除这些干扰可以通过用靶点蛋白与化合物长时间共处，然后用质谱、核磁等技术看看蛋白是否被化学修饰。

有些蛋白-配体的结合方式也很难优化，如别构抑制剂。当然现在有人专门挑战这个难题，但如果你不想淌这趟浑水你可以把这些优化难度高的苗头化合物除去。如果能拿到配体-蛋白复合物共晶结构当然一目了然，如果没有也可以用核磁共振、与已知结合模式配体竞争等技术定义结合方式。找到了特异性、非共价、理想结合方式的配体后，假如生物学家也没闲着设计、验证了评价方法，你就可以开始艰难的先导物优化工作了。除了活性这个核心外，选择性、PK、溶解性、过膜性、常见脱靶活性(cyp、hERG)、基因毒性、安全性、急毒长毒、甚至CMC生产的任何一个妖怪都可能让你前功尽弃。

即使你经历了九九八十一难进入临床，佛祖让你上市的机会也只有不到10%、但这是一个good problem to have。彻底调查先导物身份是基础、识别乌龙的火眼金睛非常关键，当年赛诺菲曾经是PARP抑制剂的领头羊，遗憾的是他们用的化合物却不是一个真正的PARP抑制剂。不仅自己失败两个三期临床损失巨大，还差点把整个领域带到沟里。不仅小分子，Medivation还曾经收购一个伪PD-1抗体。新药是极其罕见的物种、哪能轻易遇到?无论一个化合物如何温文尔雅都要进行彻底的排查。Trust but verify。

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